准备工作


实验开始前,检查准备实验所需设备及试剂,试剂盒需从冷藏环境中取出,置于20-25℃平衡1h以上,酶标仪开机预热

 

样品前处理

 

打开电子天平,放上称量纸,去皮清零


称取经过充分混匀的粉碎后的小麦样本5(±0.01)g,转移到做好标记的50ml离心管中


用移液管移取25ml去离子水加入到盛有样本的离心管中,盖紧离心管盖


在涡旋振荡器上剧烈振荡5min,转速为2500rpm,振荡时样本应与提取液充分混合


振荡后静置3min


准备好过滤所需新的离心管和定量滤纸


将静置过的样品与提取液混合物用定量滤纸进行过滤,弃掉前三滴,收集上清液


过滤时可在滤纸侧面插入一个枪头,方便空气进入,加快流速


取用一个7ml带塞离心管做好标记,用100-1000ul移液器取4ml去离子水加入到离心管中


再取1ml过滤后得到的上清液加入到离心管中,注意实验中必须使用一次性枪头,吸取不同试剂时需更换


盖紧离心管盖,手摇5s,得到待检液体


检测步骤

 

取出回温好的酶标板


10-100μl移液器取50μl各浓度的标准品及1:4稀释后的待检样品液(斜贴壁45度)加入到微孔中,每种液体点双孔


加每种液体前先润洗枪头2-3次,减少误差


实验中所有移液均采取反向移液(吸二打一),每次吸取不同试剂需注意更换枪头,避免交叉污染


加入酶标物50μl/孔


再加入抗试剂50μl/孔


轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后做好标记,置于25℃避光环境中反应15min


在反应期间,可进行洗液配制和酶标仪模板设置


用量筒量取45ml去离子水


再用100-1000μl移液器取5ml浓缩洗涤液加入到去离子水中


充分混匀,得到工作浓度洗涤液


点击酶标仪主页面左侧面的项目,点击新建


输入模板名称,主波长和次波长分别为450nm和630nm,纵向布板


拟合算法为CS算法,标准品个数为5个,浓度单位选择ppb,点击下一步


标准品设置自动重复次数为2,依次输入各标准品浓度,点击下一步


进行样品设置,输入样品个数,重复次数为2次,稀释倍数为1倍,点击下一步


点击标准品,设置标准品位置,点击样品,设置样品位置,点击完成


点击测量,选择要使用的目标模板,等待测量


取出反应到时的酶标板,进行洗板


小心揭开盖板膜,将孔内液体甩干


100-1000μl移液器取250μl配制好的工作浓度洗涤液(垂直悬空)加入到各微孔中


轻轻振荡混匀,甩干


重复洗板5次,每次间隔10s


用毛巾和吸水纸包裹,进行拍干,检查有无气泡,拍干后如有气泡可用未使用过的枪头戳破


10-100μl移液器取100μl底物液加入到各微孔中


盖上盖板膜,置于25℃环境中避光反应5min


小心揭开盖板膜,用10-100μl移液器取50μl终止液(垂直悬空)加入各微孔中,终止反应


放入酶标仪,点击开始检测,等待测量结果


打印OD值和结果


注意事项

 

1、试剂及样本没有回到室温(2025℃)会导致所有标准品的OD 值偏低。

2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况,则会出现标准曲线不成线性,重复性不好的现象,所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、每加一种试剂前需将其摇匀。

4、反应终止液为 2M 硫酸,避免接触皮肤。

5、不要使用过了有效日期的试剂盒;也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂,掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低;不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

6、储存条件

保存试剂盒于 28℃,不要冷冻,将不用的酶标板微孔板放进锡箔袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感,因此要避免直接暴露在光线下。

7、试剂变质的迹象

发色试剂有任何颜色表明发色剂变质,应当弃之。0 标准的吸光度(450/630nm)值小于 0.5A450nm<0.5)时,表示试剂可能变质。

8、加入底物液后,一般显色时间为 5min。若颜色较浅,可延长反应时间到 7min。反之,则减短反应时间。

9、浓缩洗涤液如有结晶属正常现象,请加热溶解后使用。

10、 该试剂盒最佳反应温度为 25℃,温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。


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2017-11-08

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发布者:华安麦科

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